2.1. 参与者

33 名参与者接受了筛查，其中 17 名未顺利获得筛查（图 5）。9 名参与者[平均（SD）年龄 9 岁 4 个月（5 岁 1 个月）；88% 为男性] 被随机分配先接受安慰剂治疗（A 组），7 名被随机分配先接受治疗（B 组）。所有参与者均未被诊断出患有遗传性疾病，一半人在发育过程中经历了神经发育倒退，一名患有癫痫（补充表 S1）。依从性极佳（> 90%），尽管安慰剂补充剂粉末的依从性略有降低（80%），但差异不显著。大多数参与者表现出柠檬酸合酶显著升高和 C1 缺乏。各组之间的特征没有显著差异。

2.2. 线粒体酶学

在大多数参与者中，CS 在治疗前升高，然后随着补充治疗而显着下降至正常水平（图 1 A）[F（1,24）= 6.49，p <0.05]。

校正后（图 1 B、C）复合物 1 和 2 的活性未受到线粒体补充的显著影响。经 CS 校正的复合物 4 活性[F(1,23.9) = 8.28, p < 0.01；见图1 D]与安慰剂组相比，线粒体补充显著增加。

2.3. 线粒体呼吸测定法

该补充剂提高了平均ATP连接呼吸 (ALR) [治疗 × 访视：F(1,1515) = 3.99，p < 0.05，图 2 A]，并阻止了ALR随着生理压力的增加而下降 [治疗 × 访视 × DMNQ：F(1,1506) = 12.18，p < 0.001，图 2 A]，表明服用补充剂后线粒体的弹性得到改善。相比之下，安慰剂治疗组ALR随生理压力的增加而下降。

服用补充剂治疗后，PLR 随着生理压力的增加而显著增加 [治疗 × 访视 × DMNQ：F(1,1514) = 4.41，p < 0.05，图 2 B]，表明服用补充剂后，PLR 更有效地用于控制生理压力。相反，服用安慰剂则产生了相反的效果。

补充剂治疗显著提高了平均最大呼吸容量 (MRC) [治疗 × 访视：F(1,1508) = 66.07, p < 0.001，图 2 C]，表明与安慰剂相比，针对线粒体的补充剂改善了整体线粒体容量。安慰剂治疗后，MRC 无统计学显著变化。

线粒体补充剂提高了平均储备能力 (RC) [治疗 × 访视：F(1,1511) = 97.61，p < 0.001]，并提高了 RC 随着生理压力增加而发生的变化 [治疗 × 访视 × DMNQ：F(1,1492) = 20.28，p < 0.001，图 2 D]，在低水平和中等水平的生理压力下，平均 RC 均有所提高。安慰剂治疗组 RC 无统计学显著变化。

在高水平生理应激下，治疗后的RC低于治疗前的RC。这表明，针对线粒体的补充剂提高了线粒体对轻度和中度生理应激的抵抗力，但在高水平生理应激下失去了这种能力。

我们研究了补充剂的效果是否取决于VABC定义的发育障碍水平。除PLR外，所有呼吸参数均显示补充剂的效果在低功能组中更为明显（图3，高功能亚组的图表见补充图S2）。

线粒体靶向补充剂可使ALR升高，且不受生理应激的影响，但安慰剂组则无此现象，且仅对低功能受试者有效[治疗 × 访视 × VABC（高 vs. 低）：ALR F(1,1326) = 29.35，p < 0.001]（图3 A）。高功能受试者的ALR未见明显变化（补充图S2）。因此，线粒体靶向补充剂可提高低功能受试者的线粒体产生ATP的能力。

补充剂对平均 MRC 和 RC 的影响[治疗×访问×VABC（高与低）：MRC：F（1,1332）= 87.55，p < 0.001；RC：F（1,1332）= 48.30，p < 0.001]以及随着生理压力增加而导致的 MRC 和 RC 的变化[治疗×访问×DMNQ×VABC（高与低）：MRC：F（1,1323）= 13.87，p < 0.001；RC：F（1,1323）= 20.39，p < 0.001]对于低功能和高功能个体而言不同。治疗增加了平均 MRC 和 RC，并允许 RMC 和 RC 在生理压力增加时保持高呼吸（图 3 B，C），但对高功能个体则没有这种影响（补充图 S2）。

对于低功能个体，无论生理压力水平如何，治疗后的MRC均维持在治疗前的MRC以上。然而，对于低功能个体，在高生理压力水平下，治疗后的RC低于治疗前的RC。这表明，针对线粒体的补充剂可以提高低功能自闭症谱系障碍 (ASD) 个体的线粒体对轻度和中度生理压力的抵抗力。

2.4. 行为和认知结果

行为和认知结果测量的统计结果如表 1所示。

与安慰剂相比，补充剂组的VABS VABC、沟通能力、日常生活技能和社交能力（图 4 A-D）均得到显著改善，且效果显著（表 1）。

该补充剂改善了ABC的社交退缩、多动和言语不当（图4 E-G），且效果显著。易怒和刻板行为（补充图S3）以及ABC总分（图4 H）在使用补充剂后有所改善，但统计学意义不显著。ABC总分达到临界显著水平，效果中等。

与安慰剂相比，补充剂并未显著减轻照护者的压力（图 4 I），尽管观察到了改善的趋势。补充剂对 PRAS-ASD 或 SP2 无显著影响，尽管服用补充剂后，两者均有所改善（补充图 S4 和 S5）。

两项 OACIS 严重程度量表，焦虑[安慰剂前：3.0 (1.6)，后 3.4 (1.3)，补充剂前 3.5 (1.4)，后 2.8 (1.5)] 和感觉[安慰剂前：4.3 (1.4)，后 4.8 (1.7)，补充剂前 4.3 (1.7)，后 3.6 (2.0)]，在补充剂后得到改善，且效果大小为中等到大。与安慰剂相比，补充剂对 CARS（补充图 S6）和 GCA（补充图 S7）均没有变化。补充剂对 CYBOS-ASD 影响甚微（补充图 S8）。

2.5. 响应者分析

与安慰剂组相比，接受补充剂治疗的儿童在VABS日常生活技能和社交量表、ABC社交退缩和多动量表以及PRASC言语沟通量表上，有更多儿童表现出临床显著的响应（表1）。临床医生和心理测量师评定工具的响应情况无差异。

2.6. 不良事件

一名患者在服用线粒体补充剂期间出现了轻度短暂性便秘、腹泻和胃酸反流。未出现严重不良事件。患者未出现自杀企图或自杀意念，或出现明显的自残行为。MDOTES 发现，服用补充剂后，参与者报告食欲下降的频率显著升高。由于这些并非新发事件，而是持续症状的轻度恶化，因此不被视为不良事件（参见补充表 S2-S4）。

3.1. 有针对性的补充可改善线粒体功能

本研究的主要目的是确定该补充剂是否能改善线粒体功能，以 PBMCs 中的口腔细胞酶学和呼吸作用来衡量。

治疗前，CS显著升高，ETC复合物I、II和IV显著降低。服用补充剂后，CS部分恢复正常。CS升高表明线粒体增殖，这可能是为了补偿功能不佳的线粒体。CS部分恢复正常表明，针对线粒体的补充剂能够在12周的治疗中部分恢复正常的线粒体健康。然而，经CS校正后的ETC活性变化不大，这表明线粒体的生理内在缺陷并未得到修复，而是线粒体在这些缺陷的情况下能够更好地发挥作用。这种效应可能是顺利获得支持活性氧控制系统和/或支持线粒体修复机制（包括裂变、融合和线粒体自噬）来产生更优化的线粒体来实现的。无论机制如何，这些数据表明，自闭症儿童的线粒体功能可以在短时间内发生部分改变。更长时间的治疗可能对线粒体 CS 正常化产生更大的影响，并且可能导致 ETC 活动的变化。

在本研究中，我们发现针对线粒体的补充剂可增加PBMC呼吸频率，一些呼吸参数对生理压力的适应性更强。例如，如图3所示，在补充剂治疗中，ALR随着生理压力的增加而保持稳定，而在安慰剂治疗中，ALR随着生理压力的增加而降低。在补充剂治疗中，PLR随着生理压力的增加而增加。这很可能表明质子泄漏的募集是为了控制线粒体内膜的生理压力。有趣的是，安慰剂治疗后，ALR和PLR的变异性增加。我们假设安慰剂曲线中的标准误差较大，因为没有治疗来稳定线粒体功能，从而导致结果更加多变。在补充剂治疗中，MRC和RC在整个生理压力挑战过程中都保持高于基线MRC和RC，但在最高水平的生理压力下，RC确实失去了这种升高。当使用VABC将参与者按发育能力分开时，我们发现这些观察到的效应是由功能较低的自闭症谱系障碍患者驱动的。

MOST 是为研究线粒体对生理应激的反应而开发的 [ 5,8 ]。顺利获得该检测发现，约 33% 的 ASD 儿童（称为 AD-A LCL）的 L​​CL 呼吸频率加快，包括呼吸频率是正常值的两倍 [ 5,8 ] 。之前我们利用 MOST 发现，呼吸频率加快时，对生理应激的敏感性会更高。研究还发现，患有神经发育倒退的 ASD 患儿亚组的 PBMCs 也具有此特征 [ 7 ] 。有趣的是，这种呼吸频率加快和更易受伤害的模式可在 LCLs 长期暴露于低水平氧化应激中诱发 [ 19 ]，并且与 ASD 患者 PBMCs 产前暴露于空气污染 [ 20 ] 或产前缺乏营养金属 [ 21 ] 有关。

3.2. 靶向线粒体补充可改善ASD核心症状

几项由家长完成的结果显著且效果显著，包括用VABS评定的沟通、社交和日常生活技能，以及用ABC评定的社交退缩和多动。除沟通之外，所有这些变化均超过了最小临床重要差异（MCID），表明它们在统计学和临床​​上均具有显著意义。虽然沟通能力未超过最小临床重要差异，但研究发现，在持续治疗期间，PRASC评定的沟通能力改善率显著高于安慰剂治疗期间。

顺利获得观察和家长提问，临床医生判断补充治疗后焦虑和感觉问题的严重程度有所降低，但他们并未发现其他方面有所改善，而这些方面在家长的评分量表中有所改善。需要注意的是，临床医生仅在陌生环境中对孩子进行了短时间的观察，因此在这种人工环境中，这些变化可能并不明显。一般认知能力测试在DAS量表上没有改善。这类测试需要足够的注意力和参与度，而这可能并非达到标准。

3.3. 与其他治疗研究的比较

一些治疗线粒体疾病的主要疗法也用于治疗自闭症儿童。两项DPBC研究采用了比本研究（10-25 mg/kg/d）更高的肉碱剂量（N = 30, 100 mg/kg/d [ 10 ]；N = 30, 50 mg/kg/d [ 9 ]），结果发现CARS有所改善。两项DBPC研究在利培酮中添加了肉碱，结果发现ABC分量表（多动、社交退缩、言语不当）有所改善，与本研究结果相似[ 11 , 12 ]。

一项开放标签研究使用 400 mg/kg/天肉碱 [ 13 ] ，另一项使用 100 mg/天泛醇 [ 15 ] ，发现言语研讨有所改善，与本研究类似；而另一项研究发现，使用 30-60 mg/天泛醌治疗后氧化应激的改善与 CARS 评分的提高相关 [ 16 ] 。

一项对照研究检查了一种与本研究中使用的治疗方法类似的维生素/矿物质补充剂，结果表明，父母报告称，多动、发脾气和接受性语言有所改善，ATP、NADH 和 NADPH 血液浓度也有所改善 [ 22 ]。

仅有一项研究采用与本研究类似的方法，对患有自闭症谱系障碍（ASD）和线粒体功能障碍的选定个体进行了治疗。治疗药物包括肉碱、辅酶 Q10 和α-硫辛酸 [ 18 ]。与本研究相似，研究对象在社交退缩和言语不当（ABC）分量表方面以及线粒体活动方面均有所改善。

总体而言，本研究扩展了这些先前的研究，以确认并进一步扩展针对线粒体的补充剂能够改善自闭症核心症状及相关症状的证据。然而，我们注意到，先前的研究在所采用的治疗方法和方法上存在很大差异，因此无法进行直接比较。这是第一项显示补充剂可以直接改善线粒体功能和自闭症症状的盲法研究。

3.4. 治疗神经发育障碍中线粒体异常的重要性

线粒体功能障碍在自闭症谱系障碍 (ASD) 中非常普遍，估计患病率约为 30% [ 5 , 6 ] 至 80% [ 23 ]。虽然本研究仅限于线粒体活动异常的患者，但这并不意味着这些发现只适用于患有线粒体功能障碍的一小部分自闭症谱系障碍患者。事实上，本研究筛查的自闭症谱系障碍患者中，近 90% 符合纳入标准中定义的线粒体功能障碍，因此符合条件。研究的一个偏向是，参与者是由自闭症谱系障碍 (ASD) 领域以治疗疑难杂症而闻名的儿童神经病学家管理的，因此参与者往往会包括更多功能较低的个体。

在胎儿期神经发育过程中，线粒体在神经发生的所有阶段都发挥着核心作用，调节神经元的长度和复杂性、突触功能和过度兴奋性，并与白质连接有关 [ 5 ]。在出生后发育过程中，中枢神经系统严重依赖多种线粒体介导的机制，例如突触传递、谷氨酸-谷氨酰胺循环和神经递质稳态、谷氨酸-GABA 循环、脂肪酸和乳酸等代谢底物的神经元-星形胶质细胞穿梭、细胞间线粒体运输以及线粒体自噬 [ 5 ]。

3.5. 限制

本研究存在局限性。第一时间，样本量较小可能限制了分析检测某些治疗效果的灵敏度。其次，本研究的两个组之间没有洗脱期，因此可能出现残留效应。第三，单中心设计仅能有限地推广这些结果。第四，尽管未发现显著的不良事件，但针对线粒体的补充剂组合的耐受性数据有待进一步研究。第五，需要进一步研究以确定最佳剂量和治疗周期。

4.1. 研究设计

这项为期 24 周的双组双盲、随机、安慰剂对照、交叉研究以 1:1 分配，于 2022 年 2 月 1 日至 2024 年 7 月 31 日在 PCH（美国亚利桑那州凤凰城）进行。

4.2. 随机化

使用美国国家癌症研究所临床试验随机化工具（ http://ctrandomization.cancer.gov/tool/，2025年 3 月 5 日访问）进行随机化，最大耐受不平衡为 3。研究药剂师对随机化分配拥有独家访问权。

4.3. 研究程序

初步评估后，参与者被随机分配接受12周的活性药物治疗或安慰剂治疗。第12周结束时再次进行评估，之后参与者接受与前12周不同的治疗方案。治疗结束后再次进行评估。每次访视以及每1至4周一次，都会监测潜在不良反应 (AE)、依从性和伴随治疗。家庭将取得50美元的补偿，用于筛查、基线、第12周和第24周访视。

4.4. 干预

^{有效治疗方法是将柠檬味的SpectrumNeeds®}和QNeeds®^按体重组合服用，两者均由NeuroNeeds公司（美国康涅狄格州老莱姆市；参见表2）生产，每日分两次服用。SpectrumNeeds®是一种含有33种活性成分的粉末，可与液体或食物混合。33种补充剂中有31种未超过美国医学研究院规定的^可耐受最高摄入量(UL)。例外情况如下：

1. 烟酸含量约为 UL。SpectrumNeeds ^®中的烟酸形式为烟酰胺（也称为烟酰胺） ，不会引起潮红。

2. 叶酸含量超过最高使用量 (UL)。然而，该最高使用量仅适用于合成叶酸，即叶酸。SpectrumNeeds ^®中使用的叶酸正是非合成叶酸，现在尚无已知的最高使用量。总叶酸的一半来自微生物来源的 (6S)-5-甲基四氢叶酸氨基葡萄糖盐。另一半是亚叶酸钙，约为推荐用于先前生育过神经管缺陷孩子的孕妇剂量的一半，以及疑似脑叶酸缺乏的自闭症儿童剂量的一半至二十五分之一。已知这些剂量对自闭症儿童的耐受性良好 [ 25 ]。

泛醇（辅酶Q10的还原形式，辅酶Q10是呼吸链中的主要电子载体）以QNeeds ^®凝胶胶囊的形式给予。SpectrumNeeds ^®可以与任何液体混合，打开QNeeds ^{®凝胶胶囊，将液体挤入任何液体或食物中。}

分析证书由独立分析服务组织（美国加利福尼亚州佩塔卢马的 Eurofins USA）给予，验证每种活性成分的效力至少为 99%，并且未检测到毒性或生物（细菌、酵母或霉菌）污染。

安慰剂具有与活性治疗相同的外观、感觉和味道。SpectrumNeeds ^®是一种用罗汉果提取物调味的二氧化硅粉末，因此在对照中使用了具有相同调味剂的惰性二氧化硅粉末。制作了三种柠檬味安慰剂用于味觉测试。十名工作人员（其中一些熟悉 SpectrumNeeds ^®）分别服用安慰剂和补充剂，进行面对面品尝。试验中使用了最难以区分的安慰剂，因为有 50% 的人选择安慰剂或补充剂。这也是顺利获得查看粉末颜色来进行的。在 QNeeds ^®中，泛醇由纯净水和焦糖液着色的甘油承载，因此对于与安慰剂具有相同载体和颜色的胶囊，不含泛醇。

研究人员询问了家长关于漏服药物的情况，并检查了退回的药瓶以确保服药依从性，研究药房则对依从性进行了计算。

4.5. 纳入和排除标准

参与者由资深作者在珀斯儿童医院 (PCH) 的自闭症诊所招募。纳入标准包括：(i) 诊断为自闭症；(ii) 年龄 2 岁 6 个月至 17 岁 3 个月；(iii) 体重 15 公斤至 100 公斤；(iv) 儿童自闭症评定量表第二版 (CARS-2) 评分符合自闭症标准；(v) 鉴别能力量表 (DAS) 中的一般认知能力 (GCA) ≥ 30；(vi) 入组前 8 周未改变补充疗法、传统疗法、行为疗法和教育疗法；(vii) 有意在整个试验期间维持现有疗法；以及 (ix) 口腔拭子酶学检测评估线粒体活性异常。

排除标准包括 (i) 需要其他治疗的严重行为问题（发脾气、攻击行为、自残）；(ii) 与治疗不相容的严重疾病；(iii) 服用抗惊厥药物治疗癫痫发作或活动性癫痫；(iv) 诊断为线粒体疾病；(v) 现在正在使用 SpectrumNeeds ^®或 QNeeds ^®或同等线粒体补充剂。服用标准复合维生素的参与者也可以参与研究，因为此类复合维生素的维生素剂量远低于 SpectrumNeeds 的剂量。服用 SpectrumNeeds 或 QNeeds 的三种或三种以上成分的高剂量（定义为 RDA 的两倍或更多）的参与者被排除在外。

使用由独立研究可靠评估员修订的自闭症诊断访谈终生版本确认了 ASD 诊断。

4.6. 行为和开展结果测量

4.7. 评估保真度的建立和维护

研究人员在进行评估前均已接受执业心理学家的培训和认证。试验期间，一位心理学家负责监督工作人员，并在必要时给予反馈和再培训。

4.8. 不良反应监测

每次访视时，都会使用改良的剂量记录治疗中出现的症状 (MDOTES) 量表监测常见医学症状, 。该量表为一份包含 34 项的内容，专门询问主要身体系统、活动、睡眠、食欲和一般健康状况的常见症状。在基线，会获取任何持续症状的严重程度。新出现的症状或先前存在的症状显著恶化被归类为不良事件 (AE)，并被评定为轻度、中度或重度，且按最高严重程度计算。如果不良事件在试验开始后出现或显著恶化，则被认为与治疗相关。如果不良事件持续存在或很严重，家长可以选择减半剂量或停止干预。剂量只能减少一次，如果减少，则不得再增加。

使用哥伦比亚自杀严重程度评定量表 (C-SSRS) 和 ABC 上对自伤项目的认可来评估自杀倾向。

4.9. 线粒体酶学测量

我们使用经过验证的口腔拭子程序测定了三种ETC复合物的活性[ 37 ]。使用四支Catch-All口腔采集拭子（美国威斯康星州麦迪逊市Epicentre Biotechnologies公司）收集口腔细胞，方法是用力按压颊内壁并旋转30秒。将拭子剪下来，置于1.5 mL微量离心管中，置于干冰上运送至实验室，然后储存于−80 ℃。

使用冰冷的缓冲液（缓冲液A，ABCAM）制备口腔提取物，缓冲液A含有蛋白酶抑制剂混合物和增溶膜的非离子去垢剂，并在4 °C下高速离心去除不溶性细胞物质。取两份蛋白提取物，采用二辛可宁酸法（美国伊利诺伊州罗克福德市皮尔斯生物技术公司）分析蛋白浓度。

采用试纸条免疫捕获试验测定 50 µg 提取蛋白的 ETC 复合物 I (C1) 活性 [ 37 , 38 , 39 ]。使用滨松免疫色谱仪 (MS 1000 试纸条读数仪) 对信号进行定量分析。原始 mABS (毫吸光度) 结果已根据蛋白浓度进行校正。采用标准分光光度法在 0.5 mL 反应体积中测定 ETC 复合物 IV (C4) 和柠檬酸合酶 (CS) 的活性。

使用1至2个口腔拭子提取物（在含有月桂基麦芽糖苷和蛋白酶抑制剂混合物的冰冷300μL STE缓冲液中制备）并涡旋1分钟来测量ETC复合物II（C2）。将提取物以15,000× g离心8分钟后，取上清液。顺利获得测量泛醌引发的DCPIP氧化（以600nm处吸光度的下降来衡量），采用分光光度法测定琥珀酸驱动反应中的C2活性[ 40 ]。

呼吸复合体的特定活动最初表示为每毫克蛋白质每分钟的纳摩尔，并使用控制平均值和标准偏差将其标准化为标准化值（z分数），以更好地表示线粒体功能与正常值的偏差。

4.10. 线粒体呼吸作用的测量

血液采集和处理：参与者在筛选时以及第 12 周和第 24 周的访视时接受早晨空腹采血。将样品在 4°C 下以 1500× g离心10 分钟以分离血浆。除去血浆并用含有无 Ca ⁺² /Mg ⁺² PBS、0.1% 牛血清白蛋白和 2 mM EDTA 的室温洗涤缓冲液代替。然后将稀释的血液铺在 Histopaque-1077（Sigma Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）上，并在室温下以 400× g离心30 分钟。从界面除去 PBMCs 并用洗涤缓冲液洗涤两次。使用台盼蓝拒染法和 Countess II 自动细胞计数器（Invitrogen，ThermoFisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）计数活细胞。为了在最佳时间范围内进行 Seahorse XFe96 检测，分离过程持续时间为 90 - 120 分钟 [ 41 ]。

线粒体呼吸试验：将PBMC置于含有1 mM丙酮酸、2 mM谷氨酸和25 mM葡萄糖的检测培养基（不含酚红的无缓冲RPMI）中，加热至37 °C，pH值调节至7.4，然后悬浮细胞。XFe96板（安捷伦科技公司，美国加利福尼亚州圣克拉拉）的准备工作如下：加入25 μL 50 μg/mL聚-D-赖氨酸（EMD Millipore公司，美国马萨诸塞州伯灵顿），孵育2小时，用250 μL无菌水冲洗，在层流罩内干燥过夜，然后每孔接种4 × 10 ^5个活体PBMC。接种后，将培养板以缓慢加速度（9级中的4级）旋转至最大100 g，持续2分钟，然后停止旋转（Eppendorf 5810R型离心机，ThermoFisher Scientific）。反转培养板方向，并以相同方式再次旋转。在进行Seahorse分析之前，使用倒置显微镜观察XFe96孔，以确保PBMC均匀分布在单层中。至少使用四个重复孔以提高分析可靠性。排除明显测量探针故障、试剂注入失败或非生理测量值（ATP连接呼吸(ALR)或质子泄漏呼吸(PLR) < −1 pmol/min）的运行。

Seahorse 使用 96 孔板实时测量耗氧率 (OCR) [ 42 , 43 ]。我们已将 PBMCs 中线粒体功能的变异与免疫异常 [ 44 ]、产前环境暴露 [ 21 , 45 ] 和神经发育倒退 [ 7 ] 联系起来，并已证明我们的 PMBCs 检测具有良好的组内相关性 [ 20 ]。Seahorse 检测包含 4 个步骤，在四个不同时间段内监测 OCR 三次，以响应激活或抑制 ETC 的各种试剂（参见补充图 S1），从中可以得出几个关键参数。

氧化还原挑战：在进行 Seahorse 检测之前，将 PBMCs 在 37°C 的非 CO2 培养箱中暴露于多种浓度的 DMNQ（Sigma-Aldrich，美国密苏里州圣路易斯）中_{1小时 [} 7 ]。DMNQ 产生的超氧化物和过氧化氢类似于体内烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶产生的水平 [ 46 ]。将 DMNQ（5 mg/mL）在 DMEM XF 检测培养基（安捷伦科技）中稀释成 10X 原液，然后添加到 XF-PS 板中的细胞中 [ 8 ]。我们已经验证了 DMNQ 会增加 PBMCs 中的超氧化物 [ 7 ]。

4.11. 统计分析

意向治疗分析 [ 47 ] 因其强大的无偏倚分析能力而成为临床试验的金标准 [ 48 ]。分析使用 PASW Statistics 28.0.0.0 版（IBM SPSS Statistics，美国纽约州阿蒙克）进行，图表使用 Excel 14.0 版（微软公司，美国华盛顿州雷德蒙德）制作。以 5% 的双尾 α 值作为显著性截断值。

由于数据随机缺失，因此对缺失数据进行了多重填补（50）[ 47,49 ]。敏感性分析检查了系统偏差[ 50 ]。原始数据和处理后数据无显著差异（p >0.05）。

混合效应回归模型 [ 51 ] 估计了治疗的效果和效应量。模型包括时间效应和随机截距，以解释个体受试者的均值和变异。模型顺利获得使用 F 检验计算治疗和时间之间的相互作用（p < 0.05），检验了先验假设，即持续治疗与安慰剂治疗的结果测量变化不同。在当前 N = 16 的情况下，对于中/大效应量，f = 0.25/0.40，α 为 0.05，两组和两次测量的重复测量 F 检验，重复测量之间的相关性为 0.8，非球形校正 = 1.0，功效为 84%/99%。

对于Seahorse线粒体测量，DMNQ的影响被建模为多项式。此外，Seahorse数据被分为两个大小相等的高功能亚组和低功能亚组，分别定义为高于或低于平均VABS适应行为综合评分(VABC)。

使用混合模型逻辑回归进行疗效分析。疗效者定义为超过最小临床重要差异 (MCID) 的患者（如有）。ABC [ 3 ]、VABS [ 3 ]、CYBOCS-ASD [ 52 ] 和 CARS [ 53 ] 均已定义 MCID。对于 CGI-I 和 OACIS 改善量表，“明显好转”或“非常明显好转”的评分是定义疗效的标准。年龄、基线语言能力和基线总体发育水平（以 VABC 标准化评分为指标）被纳入为潜在协变量。

使用 Fisher 精确检验法评估 AE 的严重程度频率。